五种不同组织结构特点昆虫的总RNA提取效率比较 *

doi:10.7679/j.issn.2095-1353.2020.102

五种不同组织结构特点昆虫的总RNA提取效率比较 ^*

尹志勇^,¹^,^**, 郭建军¹, 陈绪美¹, 郑玉琳¹, 田莹¹, 檀军^,¹^,²^,^***

1. 贵州大学昆虫研究所,贵州山地农业病虫害重点实验室,贵阳 550025

2. 遵义医科大学,组织学与胚胎学教研室,遵义 563003

Comparison of the effectiveness of the Trizol method versus an RNA extraction kit for extracting total RNA from insect species with different tissue characteristics

YIN Zhi-Yong^,¹^,^**, GUO Jian-Jun¹, CHEN Xu-Mei¹, ZHENG Yu-Lin¹, TIAN Ying¹, TAN Jun^,¹^,²^,^***

1. Institute of Entomology, Guizhou University, Guizhou Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management of the Mountainous Region, Guiyang 550025, China

2. Department of Histology and Embryology, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China

通讯作者: *** E-mail：juntan@zmu.edu.cn

**第一作者First author,E-mail： 2329723038@qq.com

收稿日期: 2020-01-6 接受日期: 2020-04-15 网络出版日期: 2020-07-27

基金资助:

*国家自然科学基金项目.  81803968
资源昆虫学研究科技创新团队.  黔教合人才团队字[2015]71
贵州省昆虫信息系统与资源开发利用重点实验室.  黔科合LH字[2015]7685号

Corresponding authors: *** E-mail：juntan@zmu.edu.cn

Received: 2020-01-6 Accepted: 2020-04-15 Online: 2020-07-27

摘要

【目的】 比较RNAeasy抽提试剂盒法和Trizol提取法对不同种昆虫总RNA提取的效率,为不同种昆虫总RNA提取方法选择提供参考。【方法】 采用RNAeasy抽提试剂盒法和Trizol提取法分别对九香虫Aspongopus chinensis Dallas、白背飞虱Sogatella furcifera Horváth、中华蜜蜂Apis cerana cerana、黄蜻Pantala flavescens和蒿金叶甲Chrysolina aurichalcea 进行总RNA提取,通过紫外分光光度计测定总RNA吸光度（OD）值,利用琼脂糖凝胶电泳检测等方式对RNA质量进行评估。【结果】2种提取方法提取不同昆虫总RNA中,Trizol法提取白背飞虱（同翅目）、蒿金叶甲（鞘翅目）和九香虫（半翅目）的总RNA浓度较高,但纯度较低。电泳结果显示总RNA有降解,完整性较差,RNAeasy抽提试剂盒法提取黄蜻（蜻蜓目）和中华蜜蜂（膜翅目）的浓度较低,纯度较高,电泳结果显示完整性较好。【结论】 Trizol法更适合提取小型或几丁质含量高的昆虫,RNA抽提试剂盒法更适合几丁质含量较少、腹软且有大量体液的昆虫总RNA提取。

关键词： 昆虫总RNA ; 提取方法 ; 提取效率 ; 紫外分光光度 ; 琼脂糖凝胶电泳

Abstract

[Objectives] The relative efficiency of using a RNA extraction kit to extract total RNA from different insects was compared to that of the Trizol method. [Methods] An RNA extraction kit and Trizol were used to extract total RNA from five insects; Aspongopus chinensis Dallas, Sogatella furcifera Horváth, Apis cerana cerana, Pantala flavescens and Chrysolina aurichalcea. The quality and the OD value of total RNA obtained were measured with a UV spectrophotometer and agarose gel electrophoresis. [Results] Although a higher concentration of total RNA was extracted with the Trizol method from three species, S. furcifera, C. aurichalcea, and A. chinensis, it had lower purity and electrophoresis results indicated that it was degraded with poor integrity. Conversely, although the concentration of total RNA obtained with an RNA extraction kit from P. flavescens (Odonata) and A. cerana cerana (Hymenoptera) was relatively low, it was relatively pure and had better integrity. [Conclusion] The trizol method is more suitable for extracting total RNA from small insects or those with high chitin content, whereas an RNA extraction kit is better for insects with low chitin content, a soft abdomen and more body fluid.

Keywords： insect RNA ; extraction method ; extraction efficiency ; ultraviolet spectrophotometer ; agarose gel electrophoresis

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本文引用格式

尹志勇, 郭建军, 陈绪美, 郑玉琳, 田莹, 檀军. 五种不同组织结构特点昆虫的总RNA提取效率比较 ^*. 应用昆虫学报[J], 2020, 57(4): 988-994 doi:10.7679/j.issn.2095-1353.2020.102

YIN Zhi-Yong, GUO Jian-Jun, CHEN Xu-Mei, ZHENG Yu-Lin, TIAN Ying, TAN Jun. Comparison of the effectiveness of the Trizol method versus an RNA extraction kit for extracting total RNA from insect species with different tissue characteristics. Chinese Journal of Applied Entomology[J], 2020, 57(4): 988-994 doi:10.7679/j.issn.2095-1353.2020.102

生物总RNA在生物学研究中具有重要作用,高质量的RNA是进行功能基因的克隆及差异表达分析、Northern杂交、cDNA文库构建等实验的基础。总RNA分离提取方法较多,如胍/热酚法（Feramisco et al.,1992）、氯化胍法（Cox et al.,1968）、异硫氰酸胍法（Chomczynski and Sacchi,1987）等,但这些方法花费时间和成本较多。目前,Trizol提取法和RNAeasy抽提试剂盒法的应用比较广泛。昆虫种类繁多,与其他动物或植物相比,不同种类,尤其是不同目的昆虫,其形态结构、多糖、脂肪及蛋白等含量差异较大,而这些差异可能会影响昆虫总RNA提取效率（章玉萍等,2017）。能否根据不同种昆虫的组织结构特点来选取更合适的总RNA提取方法?尚未见相关文献报道。本研究利用Trizol法和RNAeasy抽提试剂盒法提取5种昆虫的总RNA,通过对比总结不同目昆虫高效、高质量的总RNA提取方法,为不同组织结构昆虫总RNA提取方法选择提供参考。

本文选用九香虫Aspongopus chinensis Dallas、白背飞虱Sogatella furcifera Horváth,中华蜜蜂Apis cerana cerana、黄蜻Pantala flavescens和蒿金叶甲Chrysolina aurichalcea为供试昆虫。其中,白背飞虱属于半翅目同翅亚目飞虱科的小型迁飞性昆虫（黄所生等,2014）,蒿金叶甲体小型,是危害沙蒿、白茨的重要害虫,在内蒙古阿拉善左旗发生面积较大,危害严重（吕文宪和刘云生,1987）。九香虫属昆虫纲半翅目兜蝽科昆虫,具有理气止痛、温中助阳之功能（国家药典委员会,2010）。黄蜻隶属于蜻蜓目蜻科黄蜻属,体中到大型,腹腔充满血液等体液,是天敌昆虫和药用、食用昆虫,也是水体污染程度的指示昆虫之一（葛怡情和曹玲珍,2016）。中华蜜蜂简称中蜂,体小型,腹腔充满血液等体液,是我国特有的蜜蜂种质资源,是主要的传粉昆虫,对许多植物的授粉繁衍有着不可替代的作用,具有重要的经济价值和社会效益,对我国生态环境的保护有十分重要的意义（卢一浪,2019）。上述昆虫分别隶属于半翅目、同翅目、膜翅目、蜻蜓目、鞘翅目昆虫,均是常见的具有药用或经济价值的资源昆虫或常见害虫,且形态大小差异较大,具有较好的研究价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

蒿金叶甲、中华蜜蜂和黄蜻采集自贵州大学西校区崇学楼前试验田（东经106°39′,北纬26°27′）,白背飞虱和九香虫由贵州大学昆虫研究所养殖,所有样本均置于﹣80 ℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂和仪器

Trizol溶液（北京康为世纪生物科技有限公司）、氯仿溶液（南京森贝伽生物科技有限公司）、异丙醇溶液（重庆川东化工有限公司）、无水乙醇溶液（重庆川东化工有限公司）、RNAeasy抽提试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）;

NanoDrop 2000/2000C（美国赛默飞世尔公司）,Bio-Rad凝胶成像仪（美国伯乐公司）,冷冻离心机（德国Sigma公司）

1.3 实验方法

1.3.1 Trizol法提昆虫总RNA 取昆虫组织于研钵中加入液氮充分研磨,转移到1.5 mL离心管中,加入600 µL Trizol溶液,振荡30 s后室温下放置5 min;加入160 µL氯仿,振荡15 s后室温放置3 min,4 ℃,12 000 ×g 离心20 min;取上层无色水相于RNAse-free离心管中,向离心管中加入等体积异丙醇（160 µL）,颠倒混匀,室温放置30 min;4 ℃,12 000 ×g 离心20 min,弃上清;加入600 µL 75%乙醇洗涤沉淀,4 ℃,12 000 ×g 离心3 min,弃上清;室温放置3 min,晾干,加入50 µL DEPC水,–80 ℃保存。

1.3.2 RNAeasy抽提试剂盒法提昆虫总RNA 取昆虫组织置于研钵中加入液氮研磨成粉末,立刻加入600 µL裂解液,用移液枪轻轻吹打8次,室温下放置3 min;14 000 ×g离心2 min,将上清液移至新离心管;加入等体积结合液（600 µL）,轻轻颠倒混匀5次,移至纯化柱中,12 000 ×g离心30 s;加入600 µL洗涤液Ⅰ,12 000 ×g离心30 s;加入600 µL洗涤液Ⅱ,12 000 ×g离心30 s;再加入600 µL洗涤液Ⅱ,12 000 ×g离心30 s,弃离心产物,14 000 ×g离心2 min,去除残留的液体;将RNA纯化柱置于RNA洗脱管中,加入50 µL洗脱液,室温放置3 min,14 000 ×g离心30 s;重复洗脱一次,–80 ℃保存。

1.3.3 RNA浓度与纯度测定用分光光度计测定昆虫总RNA浓度及OD值。测定前用DEPC水校正,换样前均采用DEPC水洗涤测量孔,以避免样本与样本间的交叉污染。

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,用Bio-Rad凝胶成像仪曝光并拍照。

1.4 数据统计与分析

实验设置3次重复,实验数据采用SPSS 18.0软件进行独立样本T-检验分析,以平均值±标准误（mean±SE）表示（RNA含量=RNA浓度×洗脱液体积/昆虫组织质量）。

2 结果与分析

2.1 昆虫质量记录

对实验所用昆虫进行称重,如表1所示。洗脱液体积为50 µL。

表1 单只昆虫质量（g）

Table 1 Insect mass and eluent volume

	Trizol法 Trizol method	RNAeasy抽提试剂盒法 RNAeasy extraction kit method
白背飞虱 Sogatella furcifera Horváth	0.001	0.001
蒿金叶甲 Chrysolina aurichalcea	0.024	0.024
黄蜻 Pantala flavescens	0.206	0.261
中华蜜蜂 Apis cerana cerana Fabricius	0.093	0.084
九香虫 Aspongopus chinensis Dallas	0.387	0.384

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2.2 总RNA含量和OD_260/280

紫外分光光度计检测结果表明,Trizol法提取的5种昆虫总RNA含量较高（表2）,但纯度不高（表3）。Trizol法提取的白背飞虱、蒿金叶甲、黄蜻、中华蜜蜂和九香虫的总RNA OD_260/280分别为（1.54±0.02）、（1.90±0.11）、（1.88±0.03）、（1.68±0.01）和（1.79±0.06）,其中白背飞虱的总RNA可能有蛋白污染;九香虫、黄蜻和蒿金叶甲的总RNA浓度和纯度均较高。2种方法提取的中华蜜蜂含量无差异（P>0.05）,但Trizol法提取的总RNA纯度较低,提示可能有蛋白质污染（表2）。

表2 2种RNA提取方法提取的RNA含量（ng/mg）

Table 2 RNA content extracted by two RNA extraction methods (ng/mg)

	白背飞虱 Sogatella furcifera	蒿金叶甲 Chrysolina aurichalcea	黄蜻 Pantala flavescens	中华蜜蜂 Apis cerana cerana	九香虫 Aspongopus chinensis
Trizol法 Trizol method	8 868.33±3 758.77^*	2 058.47±1 398.60^*	482.48±258.13	145.65±47.15	147.86±28.19
RNAeasy抽提试剂盒法 RNAeasy extraction kit method	213.33±10.14	156.11±41.22	76.30±3.28	93.33±7.56	63.16±17.32

Data in the table are mean ± SE, * indicates significant difference (P < 0.05), ** indicates extremely significant difference (P < 0.01). The same below.

表中数据为平均值±标准误,*差异显著（P<0.05）,**差异极显著（P<0.01）。下表同。

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表3 2种RNA提取方法提取的OD_260/280

Table 3 OD_260/280 of RNA extracted by two methods

	白背飞虱 Sogatella furcifera	蒿金叶甲 Chrysolina aurichalcea	黄蜻 Pantala flavescens	中华蜜蜂 Apis cerana cerana	九香虫 Aspongopus chinensis
Trizol法Trizol method	1.54±0.02^**	1.90±0.11	1.88±0.03^**	1.68±0.01^**	1.79±0.06^**
RNAeasy抽提试剂盒法RNAeasy extraction kit method	2.02±0.04	2.19±0.01	2.15±0.003	2.09±0.01	2.06±0.01

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RNAeasy抽提试剂盒提取昆虫总RNA浓度较Trizol法低,但纯度较好,重复性较好。其中,九香虫、黄蜻、白背飞虱和蒿金叶甲纯度较高,但浓度较低。Trizol法提取总RNA浓度组内差异较大,导致统计分析结果的标准误较大（表2）,表明Trizol法提取总RNA的重复性较差。

2.3 琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量

2.3.1 Trizol法提取的总RNA质量分析由图1可见,Trizol法提取九香虫、中华蜜蜂、黄蜻和白背飞虱总RNA的18S、28S条带不清晰（图1：A,B,C,E）,表明RNA有降解,但蒿金叶甲总RNA的18S、28S条带清晰（图1：D）,完整性、重复性较好,蒿金叶甲体型较小且几丁质含量较高,可能适合使用Trizol法提取,但总体来说Trizol法提取昆虫总RNA的标准误较大,表明其提取的重复性较差,且总RNA降解较明显。

图1

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图1 琼脂糖凝胶电泳检测Trizol法提取昆虫总RNA图

A. 九香虫;B. 中华蜜蜂;C. 黄蜻;D. 蒿金叶甲;E. 白背飞虱;泳道1-3,4-6,7-9代表3个重复实验结果。

Fig. 1 Agarose gel electrophoresis detect the RNA extracted by Trizol method

A. A. chinensis; B. A. cerana cerana; C. P. flavescens; D. C. aurichalcea; E. S. furcifera; Lane 1-3, 4-6, 7-9 represent 3 independent experiments.

2.3.2 RNAeasy动物RNA抽提试剂盒法提取的总RNA质量分析由图2可见,RNAeasy抽提试剂盒提取九香虫、中华蜜蜂、黄蜻和蒿金叶甲的总RNA的18S、28S条带清晰完整性较好（图2：A,B,C,D）,但白背飞虱组未见明显条带（图2：E）,其中白背飞虱体小,在分离组织时总RNA可能被自身所带的核酸酶降解,表明RNAeasy抽提试剂盒法对提取小型昆虫的总RNA适用性较差。但RNAeasy抽提试剂盒法提取5种昆虫总RNA的重复性均较好。

图2

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图2 RNAeasy动物RNA抽提试剂盒法琼脂糖凝胶电泳图

A. 九香虫;B. 中华蜜蜂;C. 黄蜻;D. 蒿金叶甲;E. 白背飞虱;泳道1-3,4-6,7-9代表3个重复实验结果。

Fig. 2 Agarose gel electrophoresis by RNAeasy animal RNA extraction kit

A. A. chinensis; B. A. cerana cerana; C. P. flavescens; D. C. aurichalcea; E. S. furcifera; Lane 1-3, 4-6, 7-9 represent 3 independent experiments.

3 讨论与结论

浓度、纯度和完整性等是评价RNA质量的关键,cDNA库的构建、荧光定量PCR、基因克隆等实验均对RNA的质量要求较高（秦玉蓉等,2008）,而获取高质量的RNA取决于基因组DNA、蛋白质、脂肪等污染的有效去除。本研究中,实验取样和研磨均是同一条件下进行,避免了因样本差异影响不同方法的提取效率;考虑个人操作技术的熟练程度可能会影响总RNA提取质量,此次实验的昆虫总RNA均由同一人提取,且该操作者具有较丰富的提取总RNA的经验,避免了因操作者不熟练或更换操作者而增大实验误差。此外,建议今后类似的方法比较类实验,均应由固定操作者在同等条件下完成,尽量减少人为误差。

Trizol试剂能迅速裂解细胞,从而快速地从组织或细胞中提取总RNA,并可抑制细胞释放的核酸酶,避免总RNA被降解（李冉冉等,2018）。氯仿可提取完整的总RNA,加入异丙醇后,总RNA和杂质沉淀,经过乙醇的洗涤,杂质被洗脱,获得较纯的RNA。Trizol法适用于类似白背飞虱和蒿金叶甲等小型昆虫或几丁质含量较高的昆虫,避免小型昆虫组织裂解时释放出的RNA被核酸酶所降解,可获得浓度较高的RNA;而对于中华蜜蜂和黄蜻等几丁质含量较少、腹软且有大量体液的昆虫,则适合用RNAeasy抽提试剂盒提取,组织在裂解液中迅速裂解,释放出总RNA,并特异性地结合到吸附柱上,而基因组DNA和蛋白质等其他组分可通过高速离心被有效去除,再通过3次洗涤,可充分去除特异性结合的蛋白、盐等杂质,最后用洗脱液将高纯度的RNA洗脱下来,可使昆虫体液被洗净,且该类昆虫腹软和几丁质少,不易堵塞吸附柱,吸附和纯化作用较好。2种方法提取的九香虫RNA质量均较好,但Trizol法提取的总RNA更高,所以建议使用Trizol法提取九香虫总RNA。

实验发现,使用Trizol法提取昆虫总RNA浓度高,但Trizol法提取的总RNA标准误较大,表明Trizol法重复性较差,而RNAeasy抽提试剂盒法提取昆虫总RNA浓度虽然较低,但纯度较高,且重复性较好。

综上,Trizol法适合小型昆虫或几丁质含量较多昆虫的总RNA提取,RNAeasy抽提试剂盒适合几丁质含量较少、腹软且有大量体液的昆虫总RNA提取。

参考文献

原文顺序

文献年度倒序

文中引用次数倒序

被引期刊影响因子

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, Sacchi

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Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction

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DOI:10.1006/abio.1987.9999 URL PMID:2440339 [本文引用: 1]

A new method of total RNA isolation by a single extraction with an acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform mixture is described. The method provides a pure preparation of undegraded RNA in high yield and can be completed within 4 h. It is particularly useful for processing large numbers of samples and for isolation of RNA from minute quantities of cells or tissue samples.

[2]

Cox

, 1968.

The use of guanidinium chloride in the isolation of nuclei acids

Methods Enzymol., 12(part B):120-129.